近年来，有机化学实验中已广泛使用现代分析仪器来鉴定有机化合物结构和测定有机化合物的含量。鉴定有机化合物结构利用的是各种有机化合物在波谱学性质上的差异，常用的仪器有：红外光谱（Ｉnfrared　Ｓpectroscopy，IR）仪、核磁共振（Ｎuclear　Ｍagnetic　Ｒesonance，NMR）波谱仪、紫外光谱（UV）、质谱（MS）和X衍射仪（Xray）等。色谱法（Ｃhromatography）是分离、提纯和测定有机化合物含量的重要方法，根据操作条件的不同，色谱法可分为柱色谱、薄层色谱、纸色谱、气相色谱及高效液相色谱等类型。本节简单介绍红外光谱、核磁共振波谱、气相色谱和高效液相色谱仪器的工作原理及使用方法。红外光谱仪

2.2.1红外光谱

红外吸收光谱是分子振动光谱，简称红外光谱（Infrared　Spectrometry，IR），通过谱图解析可以获取分子结构的信息，是解析有机化合物结构的重要手段之一。任何气态、液态、固态样品均可进行红外光谱测定，这是其他仪器分析方法难以做到的。

1．　基本原理

红外光谱是确定有机化合物结构最常用的方法之一。中红外区（波长为2.5～25μm）吸收光谱应用最广，它是由分子振动能级（伴随有转动能级）跃迁产生的，故又叫分子振动转动光谱。分子中原子间的振动有伸缩振动和弯曲振动。分子振动能级是量子化的，分子中的每一种振动都有一定的频率，叫作基频。当用一定频率的红外光照射有机物样品时，若该样品的某一振动频率与红外光的频率相同，则该样品就吸收这种红外光，使样品的振动由基态跃迁到激发态。因此，当使用红外分光光度计发出的红外光（波长为2.5～25μm，波数为4000～400cm-1）依次通过有机物样品时，就会出现强弱不同的吸收现象。如果以透射百分数（T）为纵坐标，波长（λ）或波数（σ）为横坐标作图，就得到该样品的红外光谱，如图212所示。

图2121辛烯的红外吸收光谱

波数（σ）与波长（λ）及频率（υ）的关系（式中c为光速）：

σ=1λ=υc

透射百分数（T）与透射光强度（I）及入射光强度（I0）的关系为：

T=II0×100%从上式可以看出，透射百分数越小，透射光强度越弱，吸收越强，曲线则越向下，倒峰越强。峰强度也可用吸光度（A）表示，A是透光率倒数的对数：A=lg（1／T）实际上，峰强度并不定量表示，而是用强峰（s）、中强峰（m）、弱峰（w）等简单描述。

化学键振动的频率与振动键的强度（力常数）及原子质量有关，它们之间的关系是：υ=12πκ1m1+1m2式中:m1、m2为两个原子的相对原子质量；κ为键的力常数。由上式可知，原子质量越小，振动越快，频率越高。例如，C—H的伸缩振动频率约为3000cm-1，比C—D的振动频率（约为2600cm-1）高。

2．　红外光谱仪简介

图213双光束红外分光光度计的构造原理图目前使用较多的有双光束色散型红外分光光度计和傅立叶变换红外光谱仪（FTIR）。双光束红外分光光度计的构造原理如图213所示。从光源发出的红外辐射分成两束：一束通过试样池，另一束通过参比池，然后进入单色器。在单色器内先通过一定频率转动的扇形镜（斩光器），其作用是使试样光束和参比光束交替进入单色器中的色散棱镜或光栅，最后进入检测器。检测器随扇形镜的转动交替接受这两束光。由检测器出来的信号通过交流放大器放大，然后通过伺服系统驱动光楔进行补偿，使两束光强度相等。若试样对某一波数的红外吸收越多，光楔就越多地遮住参比光路，以达到参比光强同样减弱，使两束光重新处于平衡。记录笔与光楔相连，使光楔的变化转化为透光率的改变。

傅立叶变换光谱方法利用干涉图和光谱图之间的对应关系，通过测量干涉图和对干涉图进行傅立叶积分变换的方法来测定和研究光谱图。与传统的光谱仪相比较，傅立叶光谱仪可以理解为以某种数学方式对光谱信息进行编码的摄谱仪，它能同时测量、记录所有谱元的信号，并以更高的效率采集来自光源的辐射能量，具有比传统光谱仪高得多的信噪比和分辨率；同时它的数字化光谱数据也便于计算机处理。

3．　红外光谱试样的制备

（1）　气体样品

气体样品的红外测试可采用气体池进行。在样品导入前先抽真空，样品池的窗口多用抛光的NaCl或KBr晶片。常用的样品池长5cm或10cm，容积为50～150mL。吸收峰强度可通过调整气体池内样品的压力来达到。对于红外吸收强的气体，只需要注入666.6Pa的气体样品；对弱吸收气体，需注入66.66kPa的样品。因为水蒸气在中红外区有吸收峰，所以气体池一定要干燥。样品测完后，用干燥的氮气流冲洗。

（2）　**样品

低沸点样品可采用固定池（封闭式**池）。封闭式**池的清洗方法是向池内灌注一些能溶解样品的溶剂来浸泡。最后，用干燥空气或氮气吹干溶剂。

图214可拆卸**池

1．　池架前板2,6．　橡皮垫片

3,5．　KBr窗片4．　控制光程长度的

铅垫片，有0.025～1mm各种规格

7．　池架后板8．　固定螺杆一般常用的是可拆卸**池，如图214所示。将样品滴在窗片（用KBr、NaCl等盐制成，又称盐片）上。再垫上橡皮垫片，将池壁对角用螺丝拧紧，夹紧窗片即可。注意：窗片内不能有气泡。

纯液样可直接放入池中，对某些吸收很强的**，可配成溶液后，再注入样品池。选用的溶剂应合适：一般要求溶剂对溶质的溶解度要大，红外透光性好，不腐蚀窗片，分子结构简单，极性小,对溶质没有强的溶剂化效应。例如，CS2、CCl4及CHCl3等，它们本身的吸收峰可以通过溶剂参比进行校正。

（3）　固体样品

固体样品的制备，除了采用合适的溶剂将固体配成溶液后，按**样品处理之外，还可采用以下几种常用方法。

图215压片机的纵剖面①　压片法：这是红外光谱分析固体样品的常用方法。将1～3mg固体样品与分析纯的KBr混合研磨（样品占混合物的1％～5％）成粒度小于2μm的细粉，用不锈钢铲勺取70～90mg磨细的混合物装在模具中，放于压片机上（压片机的纵剖面如图215所示），加压至15MPa，5min后取出。将透明的薄片样品装在固体样品架上进行测定。

压片法制得的样品薄片厚度容易控制，样品易于保存，图谱清晰，无干涉条纹，再现性良好，凡可粉碎的固体都适用，因而广为采用。

②　糊状法：大多数的固体试样在研磨中若不发生分解，则可把１～3mg研细的样品粉末悬浮分散在几滴石蜡油、全氟丁二烯等糊剂中，继续研磨成均匀的糊状，再将糊状物刮出夹在两窗片之间，然后固定好两块窗片即可测试。本法要求糊剂自身红外吸收光谱简单，折射率和样品相近，且不与样品发生化学反应。糊状物在窗片上应分布均匀。测完后，窗片应用无水乙醇冲洗，软纸擦净，抛光。

此法适用于大多数固体，操作迅速、方便。缺点是石蜡油本身在2900cm-1、1465cm-1、１380cm-１处有吸收峰，解析图谱时须将这几个峰划去。

③　薄膜法：就是将固体样品制成透明薄膜进行测定。制备方法有如下两种：

(a)　直接压膜：将样品直接加热到熔融，然后再涂制或压制成膜。此法适用于熔点较低、熔融时又不分解、不升华和不发生其他化学变化的物质。

(b)　间接制膜：将样品溶于挥发性溶剂中，然后将溶液滴在平滑的玻璃或金属板上，使溶剂慢慢挥发，成膜后再用红外灯或干燥箱烘干。也可将溶液直接滴在窗片上成膜。

薄膜法在高分子化合物的红外光谱分析中应用广泛。

一般要求在制备试样时应做到：①　选择适当的试样浓度和厚度。使最高谱峰的透射百分数在1％～5％、基线在90％～95％、大多数的吸收峰透射百分数在20％～60％范围；②　试样中不含游离水；③　多组分试样的红外光谱测绘前应预先分离。

近年来，一次性的红外样品测试卡已经应用于红外光谱的样品分析。这种方便的红外样品测试卡的载样区为直径19mm含聚乙烯（PE）或聚四氟乙烯（PTFE）的微孔膜圆片。PE和PTFE膜都是化学稳定性的，可用于4000～400cm-1的红外分析，但对样品3200～2800cm-1之间的脂肪族C—H伸缩振动有影响。所用的样品一般为含有0.5mg固体样品或5μL**样品的有机溶液。用滴管将溶解的样品滴在薄膜上，几分钟后待溶剂在室温下挥发后即可测定。非挥发性的**也可用该方法进行测定。

目前比较先进的Nicolet–Avator　360全新智能型FTIR仪配有标准取样附件和样品池。针对不同类型的样品，插入相应的智能软件即可测定。

实验测试完毕后，应将玛瑙研钵、不锈钢勺和模具接触样品部件用丙酮擦洗，红外灯烘干，冷却后放入干燥器中。红外光谱仪应在切断电源，光源冷却至室温后，关好光源窗。样品池或样品仓应卸除，以防止样品污染或腐蚀仪器。最后将仪器盖上罩，登记、记录操作时间和仪器状况，经指导教师允许方可离去。

4．　红外图谱的解析

有机分子结构不同，红外光谱表现出的吸收峰也不同。红外光谱比较复杂[1]，一个化合物的红外吸收光谱有时有几十个吸收峰，通常把红外光谱的吸收峰分为两大区域：

①　4000～1300cm-1区域：这一区域官能团的吸收峰较多，这些峰受分子中其他结构影响较小，很少重叠，易辨别，故把此区称为官能团区，又叫特征谱带区，它们是红外光谱解析的基础。

②　1300～650cm-１区域：这一区域主要是一些单键的弯曲振动和伸缩振动引起的吸收峰。在此区域出现的吸收峰受分子结构的影响较大。分子结构有微小变化就会引起吸收峰的位置和强度明显不同，就像人的指纹因人而异，所以把此区域称为指纹区。不同的化合物指纹区的吸收峰不同。指纹区对鉴定两个化合物是否相同起着关键的作用。常见官能团和化学键的特征吸收波数见表24。表24常见官能团和化学键的特征吸收波数

基团波数/cm-1基团波数/cm-1O—H3670～3580C≡N2260～2240O—H（缔合）3400～3200C≡C2250～21０0O—H（酸）3500～2500CC1650～1600N—H3500～3300CO（醛、酮）1745～1705N—H（缔合）3400～3200CO（羧酸）1725～1700≡C—H3310～3200CO（酯）1760～1720C—H3100～3020CO（酸酐）１８0０～1750Ar—H3100～3000CO（酰胺）1680～1640CH2—H2960～2860C—O1250～1100CH—H2930～2860NO2１550，1350在解析红外谱图时，可先观察官能团区，找出该化合物存在的官能团，然后再查看指纹区，如果是芳香族化合物，应找出苯环取代位置。由指纹区的吸收峰与已知化合物红外谱图或标准红外谱图[2]对比，可判断未知物与已知物结构是否相同。官能团区和指纹区的作用正好相互补充。【注释】

[1]　红外吸收光谱的三要素：位置、强度、峰形。

在解析红外谱图时，要同时注意红外吸收峰的位置、强度和峰形。吸收峰的位置（即吸收峰的波数值）无疑是红外吸收最重要的特点，因此各红外专著都充分地强调了这点。然而，在确定化合物分子结构时，必须将吸收峰位置辅以吸收峰强度和峰形来综合分析，但这后两个要素则往往未得到应有的重视。

每种有机化合物均显示若干红外吸收峰，因而易于对各吸收峰强度进行相互比较。从大量的红外谱图可归纳出各种官能团红外吸收的强度变化范围。只有当吸收峰的位置及强度都处于一定范围时，才能准确地推断出某官能团的存在。以羰基为例，羰基的吸收是比较强的，如果在1780～1680cm-1（这是典型的羰基吸收区）有吸收峰，但其强度较弱，这并不表明所研究的化合物结构中含有羰基，而是说明该化合物中可能存在着含有羰基的杂质。吸收峰的形状也决定于官能团的种类，从峰形可辅助判断官能团。以缔合羟基、缔合伯氨基及炔氢为例，它们的吸收峰位置只略有差别，主要差别在于吸收峰形不一样：缔合羟基峰圆滑而钝；缔合伯氨基吸收峰有一个小或大的分岔；炔氢则显示尖锐的峰形。

总之，只有同时注意吸收峰的位置、强度、峰形，并与已知谱图进行比较，才能得出较为可靠的结论。

[2]　标准红外谱图的应用。

最常见的红外标准谱图为萨特勒（Sadtler）红外谱图集，它有几个突出的优点：①　谱图收集丰富：该谱图中已收集有7万多张红外光谱。②　备有多种索引，检索方便：化合物名称字顺序索引（alphabetical　index）；化合物分类索引（chemical　classes　index）；官能团字母顺序索引（functional　group　alphabetical　index）；分子式索引（molecular　formula　index）；分子量索引（molecular　weight　index）；波长索引（wave　length　index）。③　萨特勒同时出版了红外、紫外、核磁氢谱、核磁碳谱等标准谱图，还有这几种谱的总索引，从总索引可以很快查到某一种化合物的几种谱图（质谱除外）。这对未知物结构鉴定提供了极为方便的条件。④　萨特勒谱图包括市售商品的标准红外谱图。如溶剂、单体和聚合物、增塑剂、热解物、纤维、医药、表面活性剂、纺织助剂、石油产品、颜料和染料等，每类商品又按其特性细分，这对于针对各类商品进行的研究十分方便，这是其他标准谱图所不及的。

【思考题】

(1)　用压片法制样时，为什么要求研磨到颗粒粒度为2μm左右？研磨时不在红外灯下操作，谱图上会出现什么情况？

核磁共振谱仪(2)　**化合物测定时，为什么低沸点样品要采用液池法？

（3）　高分子聚合物很难研磨成细小颗粒，采用什么制样方法较好？

2.2.2核磁共振氢谱

核磁共振谱（Ｎuclear　Ｍagnetic　Ｒesonance　Spectroscopy，NMR）可能是现代化学家分析有机化合物最有效的波谱分析方法。该技术取决于当有机物被置于磁场中时所表现的特定核的核自旋性质。在有机化合物中所发现的这些核一般是1H、2H、13C、19F、15N和31P，所有具有磁矩的原子核（即自旋量子数I=0）都能产生核磁共振。而12C、16O和32S没有核自旋，不能用NMR谱来研究。在有机化学中最有用的是氢核和碳核，氢同位素中，1H质子的天然丰度比较大，磁性也比较强，比较容易测定。组成有机化合物的元素中，氢是不可缺少的元素，本教材仅就1H　NMR进行讨论。

核磁共振氢谱（1H　NMR）能够提供以下几种结构信息：化学位移δ、耦合常数J、各种核的信号强度比和弛豫时间。通过分析这些信息，可以了解特定氢原子的化学环境、原子个数、邻接基团的种类及分子的空间构型。所以核磁共振氢谱在化学、生物学、医学和材料科学领域的应用日趋广泛，成为有机化合物的结构研究中一种重要的剖析工具。

1．　基本原理

核磁共振氢谱的基本原理是具有磁矩的氢核，在外加磁场中磁矩有两种取向：一种与外加磁场同向，能量较低；另一种与外加磁场反向，能量较高。两者的能量差ΔE与外磁场强度B0成正比：

ΔE=hγB0/2π

式中：γ为核的磁旋比;h为普朗克常数。

图216自旋态能量差与磁

场强度的相互关系如果在与磁场B0垂直的方向，用一定频率的电磁波作用到氢核上，当电磁波的能量hν正好等于能级差ΔE时，氢核就会吸收能量从低能态跃迁到激发态，如图216所示，即发生“共振”现象。所以核磁共振必须满足条件：hν=ΔE=hγB0/2π，即

ν=γB0/2π

式中：ν为电磁波的频率。

在实际的分子环境中，氢核外面是被电子云所包围的，电子云对氢核有屏蔽作用，从而使得氢核所感受到的磁场强度不是B0而是B′。在有机化合物分子中，不同类型的氢核周围的电子云屏蔽作用是不同的。也就是说，不同类型的质子，在静电磁场作用下，其共振频率并不相同，从而导致图谱上信号的位移。由于这种位移是因为质子周围的化学环境不同而引起的，故称为化学位移。化学位移用δ表示，其定义为：

δ=ν样品-ν标准ν0×106

式中：ν样品为样品的共振频率；ν标准为标准物的共振频率；ν0为所用波谱仪器的频率。

常用的标准物为四甲基硅烷（TMS），TMS的δ值为零。表25列出了一些常见基团中质子的化学位移。核磁共振氢谱中横轴标记为ppm（百万分之一）或用符号δ表示。表25不同类型质子的化学位移值

质子类型化学位移值质子类型化学位移值TMS0ArCH32.3RCH30.9RCHCH24.5~5.0R2CH21.2R2CCH24.6~5.0R3CH1.5R2CCHR5.0~5.7R2NCH32.2RC≡CH2.0~3.0RCH2I3.2ArH6.5~8.5RCH2Cl3.5RCHO9.5~10.1RCH2F3.7RCOOH,RSO3H10~13ROCH33.4ArOH4~5RCH2OH,RCH2OR3.6ROH0.5~6.0RCOOCH33.72.3RNH2,R2NH0.5~5.0RCOCH3,R2CCRCH32.1RCONH26.0~7.52．　核磁共振波谱仪简介

图217核磁共振原理示意图

1.　磁铁2.　扫场线圈3.　射频振**器4.　射频接收器及放大器5.　试样管6.　记录仪和示波器7.　射频线圈8.　接收线圈核磁共振波谱仪根据电磁波的来源，可分为连续波和脉冲傅立叶变换两类；如按磁场产生的方式，可分为永久磁铁、电磁铁和超导磁体三种；也可按磁场强度不同，分为　60MHz、90MHz、100MHz、200MHz、500MHz等多种型号，一般兆数越高，仪器分辨率越好。频率为60MHz，磁场强度B0为1.41mT；频率为200MHz的NMR仪，B0为　4.70mT；频率为500MHz的超导NMR仪，B0为１１.75mT。目前900MHz的超导NMR仪已经问世，这必将对有机化学、生物化学和药物化学的发展起到重要的作用。

核磁共振波谱仪主要由磁铁、射频振**器和线圈、扫场发生器和线圈、射频接收器和线圈以及示波器和记录仪等部件组成，如图217所示。

3．　核磁共振样品的制备

无黏性的**样品可用TMS作参照以纯样进行。黏性**和固体必须溶解在适当的溶剂中。最常用的有机溶剂是CCl4。随着被测物质极性的增大，要用极性大的氘代（D代）试剂。

氘代试剂作溶剂，它不含氢，不产生干扰信号。选择氘代试剂主要考虑对样品的溶解度。氘代氯仿（CDCl3）是最常用的溶剂，除强极性的样品之外均可适用,　且价格便宜，易获得。极性大的化合物可采用氘代丙酮（CD3COCD3）、重水（D2O）等。在应用重水时要小心，因为活泼氢与重水进行交换而形成氘标记的（含氘）化合物。

针对一些特定的样品，可采用相应的氘代试剂：如氘代苯（C6D6，用于芳香化合物，包括芳香高聚物）、氘代二甲基亚砜（DMSOd6，用于某些在一般溶剂中难溶的物质）、氘代吡啶（C5D5N，用于难溶的酸性或芳香物质及皂苷等天然化合物）等，但这些溶剂价格较贵。

四甲基硅烷（TMS）是最常用的内标，它加到被分析的溶液中以形成按TMS体积计为1％~4％的溶液。如果溶剂是重水，常用2,2二甲基2硅戊烷5磺酸钠（DDS）做内标，因为四甲基硅烷不溶于重水。制备NMR样品的具体步骤如下：

①　如果有足够的不黏的**样品（0.75～1.0mL），以纯样进行；固体样品取5～10mg溶于0.75～1.0mL的适当溶剂中；如是**样品则先加入1/5体积的被测物质，然后加入4/5体积的溶剂。如果溶剂不含TMS，加入1～4滴TMS。样品溶液应有较低的黏度，否则会降低谱峰的分辨率；若溶液黏度过大，应减少样品的用量。

②　制备的样品放在具有塑料帽盖的样品管中，加上盖子后摇匀。管子必须深入到足够的深度，以保证当管子的较低一端放置在与磁极、振**器和接收线圈之间时能正确地排布。一旦放置好，管子应能围绕垂直轴旋转。

4．　1H　NMR谱的解析

核磁共振氢谱可以提供有关分子结构的丰富资料[1]。根据每一组峰的化学位移值可以推测与此氢核所属官能团的类型；自旋裂分的形状还提供了邻近的氢的数目；而峰的面积可算出分子中存在的每种质子的相对数目。在解析未知化合物的核磁共振谱时，一般采取以下步骤来解析[2]。

①　首先区别有几组峰，从而确定未知物中有几种不等性质子（即谱图上化学位移不同的质子）。

②　计算峰的面积比，以确定各种不等性质子的相对数目。

③　确定各组峰的化学位移值，再查阅有关数值表，以确定分子中可能存在的官能团。

④　识别各组峰的自旋裂分情况和耦合常数，以确定各种质子的周围情况。

⑤　根据以上分析，提出可能的结构式，再结合其他信息，最终确定结构。

图218为乙醇的核磁共振氢谱。从图中可以看出，谱图可分为三组峰，化学位移由低到高的次序为δ1.17（三重峰）、δ3.58（四重峰）和δ4.40（单峰）。δ1.17的甲基峰（—CH3）受邻近—CH2—的自旋耦合，按照（n+1）规律，使甲基氢（—CH3）分裂为三重峰，耦合常数J=7.4Hz；同样，亚甲基氢（—CH2—）受—CH3中三个质子耦合分裂为四重峰，耦合常数J=7.4Hz，因为—CH3、—CH2—属相互耦合对，其耦合常数J相等。而醇羟基不受邻近质子影响为单峰。此外图中—CH3、—CH2—、—OH峰积分面积之比为3∶2∶1，与结构式中官能团的氢原子数目比相吻合。图218乙醇的1H　NMR谱图

【注释】

[1]　核磁共振图谱分为一级谱和高级谱，一级谱又叫低级谱，较容易解析。满足下列两个条件的1H　NMR　谱叫作一级谱：①　一个自旋体系中的两组质子的化学位移差（Δν）至少是耦合常数J的6倍以上，即Δν/J≥6。在此，Δν和J都用Hz作单位，Δν＝Δδ×仪器兆周数。例如，CHCl2—CH2Cl中，δCH=5.85，δCH2=3.96，J=6.5Hz，在60MHz的仪器中Δν＝（5.85-3.96）×60=113.4(Hz)，Δν/J=113.4/6.5=17.4＞6。所以，CHCl2—CH2Cl在60MHz仪器中的NMR图是一级谱。当Δν/J≤6时为高级谱。②　在这个自旋体系中同一组质子（它们的化学位移相同）中的各个质子必须是磁等价的。

[2]　符合一级谱的图谱，有以下规律:①　磁等价的质子之间，尽管有耦合，但不发生裂分，如果没有其他的质子的耦合，应该出单峰;②　磁不等价的质子之间有耦合，发生的裂分峰数目应符合（n+1）规律;③　各组质子的多重峰中心为该组质子的化学位移，峰形左右对称，还有内侧高、外侧低的“倾斜效应”;④　耦合常数可以从图上的数据直接计算出来。找出代表耦合常数大小的两个峰，由它们的化学位移差Δδ计算耦合常数，J（Hz）=Δδ×仪器兆周数;⑤　各组质子的多重峰的强度比为二项式展开式的系数比;⑥　不同类型质子的积分面积（或峰强度）之比等于质子的个数之比。

【思考题】

（1）　由核磁共振氢谱能获得哪些信息？

气相色谱仪（2）　什么是化学位移？它对化合物结构分析有何意义？

2.2.3气相色谱

气相色谱（Gas　Chromatography，GC）是20世纪50年代发展起来的一种色谱分离技术，主要用来分离和鉴定气体及挥发性较强的**混合物。由于气相色谱仪结构简单，造价较低，且样品用量少，分析速度快，分离效能高，还能与红外光谱（IR）、质谱（MS）等联用，把色谱杰出的分离性能与IR、MS等仪器的定性能力完美地结合起来，因此气相色谱已在石油化工、生物化学、医药卫生及环境保护等方面得到广泛应用。

气相色谱是以气体作为流动相的一种色谱，根据固定相的状态不同，可分为气固色谱和气液色谱，前者属于吸附色谱，后者属于分配色谱。

1．　基本原理

样品中各组分在通过色谱柱的过程中彼此分离。当惰性气体（流动相）携带着样品通过色谱柱时，由于样品中各组分分子和固定相分子之间发生溶解、吸附或配位等作用，使样品在流动相和固定相之间进行反复多次的分配平衡，由于各组分在两相间的分配系数不同，因而各组分沿色谱柱移动的速度也不同。当通过适当长度的色谱柱后，各组分彼此间就会拉开一定的距离，先后流出色谱柱，即发生分离，至检测器给出信号。

对于气液色谱，在固定相中溶解度较小的组分先流出色谱柱，溶解度较大的组分后流出色谱柱。图219是两个组分经色谱柱分离，先后进入检测器时记录仪记录的流出曲线。图中t1和t2分别是两组分的保留时间，即它们流出色谱柱所需的时间。

图219两组分经色谱柱分离后的流出曲线

2．　气相色谱仪

气相色谱仪的主要部件及流程图如图220所示。载气从高压钢瓶流出，经减压阀减压及净化管净化，用针形阀调节并控制载气的流量，通过转子流量计和压力表指示出载气的流量与柱前压。试样用进样器注入，在气化室瞬间气化后由载气带入色谱柱进行分离，分离后的各组分随载气进入检测器，检测器将组分的瞬间浓度或单位时间的进入量转变为电信号，放大后由记录器记录成色谱峰。

图220气相色谱流程图

气相色谱仪品种很多，性能和应用范围均有差异，但基本结构和流程大同小异。主要包括载气供应系统、进样系统、色谱柱、温度控制系统、检测系统和数据处理系统等部分。在气相色谱中，组分能否分离取决于色谱柱，而灵敏度大小则取决于检测器。根据色谱柱的不同，气相色谱又可分为填充柱色谱和毛细管色谱[1]，后者的分离效率更高。气相色谱中应用的检测器较多，常用的有：①　热导检测器；②　氢火焰电离检测器；③　电子捕获检测器。

3．　定性和定量分析

（1）　定性分析

气相色谱法是一种高效、快速的分离分析技术，可以在很短的时间内分离几十种甚至上百种组分的混合物，其分离效能是其他方法难以相比的。但是，仅从气相色谱图不能直接给出组分的定性结果，而要与已知物对照分析。气相色谱定性的依据是保留时间。当固定相和色谱条件一定时，任何一种物质都有一定的保留值。在同一色谱条件下，比较已知物和未知物的保留值，就可以定性出某一色谱峰对应的化合物。

但是，与已知物对照作为定性分析方法还存在一定的问题。首先，色谱法定性分析主要依据每个组分的保留值，所以需要标准样品，而标样不易得到；其次，由于不同化合物在相同条件下有时具有相近甚至相同的保留值，所以单靠色谱法对每个组分进行鉴定是比较困难的。只能在一定条件下（例如已知可能为某几个化合物或从来源可知化合物可能的类型）给出定性结果，对于复杂混合物的定性分析，目前是将气相色谱仪、质谱仪和红外光谱仪等联用。

（2）　定量分析

气相色谱常用的定量计算方法有如下三种。

①　归一化法：如果分析对象各组分的响应值都很接近，且各组分都已被分开，并出现在色谱图上，则可以用每组分峰面积占峰面积总和的百分数代表该组分的质量分数，即：

ωi=mim=AifiΣAifi

式中:ωi为i组分的质量分数；mi为i组分的质量；m为试样质量；Ai为i组分的峰面积；fi为i组分的质量校正因子。

归一化法的优点是简便、准确，操作条件（如进样量、流量）对结果影响小，适用于多组分同时分析。如果峰出得不完全，即有的高沸点组分没有流出，或者有的组分在检测器中不产生信号，则不能使用归一化法。

②　内标法：当样品中各组分不能全部流出色谱柱，或检测器不能对各组分都产生响应信号，且只需要对样品中某几个出现色谱峰的组分进行定量分析时，可采用内标法，即在一定量的样品中加入一定量的标准物质（内标物）进行色谱分析。

内标物的选择条件应满足：内标物能溶于样品中，其色谱峰与样品各组分的色谱峰能完全分离，且它的色谱峰与被测组分的色谱峰位置比较接近，其称样量与被测组分接近。

用内标法可以避免操作条件变动造成的误差，但每做一个样品都要用天平准确称量样品和内标物，比较麻烦。它适用于某些精确度要求高的分析，而不适合样品量大的常规分析。

③　外标法：外标法是用纯物质配成不同浓度的标准样，在一定的操作条件下定量进样，测定峰面积后，给出标准含量与峰面积（或峰高）的关系曲线——标准曲线。在相同条件下测定样品，由已得样品的峰面积（或峰高）从标准曲线上查出对应的被测组分的含量。

外标法操作简单，计算方便，但需严格控制操作条件，保持进样量一致才能得到准确结果。【注释】

[1]　毛细管柱（capillary　column）又叫空心柱或开管柱（open　tubular　column），是戈雷（M.　J.　E.　golay）于1957年发明的一种直径小（0.1～0.5mm）、长度长（30～300m）的管柱形毛细管。20世纪70年代初毛细柱商品化后被广泛采用。空心柱分为涂壁空心柱（wall　coated　open　tubular　column，简称WCOT柱）、多孔层空心柱（porous　layer　open　tubular　column，简称PLOT柱）和涂载体空心柱（support　coated　open　tubular　column，简称SCOT柱）。涂壁空心柱使用最为广泛，它是将固定液均匀地涂在内径0.1～0.5mm的毛细管内壁而成。毛细管的材料可以是不锈钢、玻璃或石英。这种色谱柱具有渗透性好、传质阻力小等特点，因此柱子可以做得很长。毛细管柱的制备方法比较复杂，固定液仅几十毫克，是填充柱的几十至几百分之一，故进样量极小。多孔层空心柱是在毛细管内壁适当沉积上一层多孔性物质，然后涂上固定液。这种柱容量比较大，渗透性好，故有稳定、高效、快速等优点。

由于毛细管柱的涂布需要专门的技术和设备，因此，一般使用者多购买商品色谱柱。商品色谱柱的固定液种类很多，如PEG20M、SE54、SE30、OV17、HP1、HP5等。

与填充柱比较，毛细管柱具有以下特点。①　柱容量小，允许进样量小。通常要采用分流技术，即在气化室出口将样品分成两路，绝大部分样品放空，极少部分样品进入色谱柱。放空的样品量与进入色谱柱的样品量之比称为分流比，通常控制在（50∶1）～（100∶1）。但这对微小组分的分析不利，定量分析的重现性也不如填充柱好。②　柱效高，大大提高了分离复杂混合物的能力。毛细管的理论塔板数比填充柱高2～3个数量级。由于载气线速大，柱容量小，因此色谱峰形窄，出峰快，不同组分容易分开。③　渗透率大，载气阻力小，相比大，可使用长色谱柱，有利于提高柱效和实现快速分析。高效液相色谱仪

2.2.4高效液相色谱

高效液相色谱又称为高压液相色谱（High　Performance　Liquid　Chromatography，HPLC），是20世纪70年代初发展起来的一种高效、快速的分离分析有机化合物的方法，它适用于高沸点、难挥发、热稳定性差、离子型的有机化合物的分离与分析。

1．　基本原理

高压液相色谱可以分为液固吸附色谱、液液分配色谱、离子交换色谱和凝胶渗透色谱等，应用最广泛的是液液分配色谱，因此，在下面的讨论中将以液液分配色谱为主。

当流动相携带着样品通过色谱柱时，样品在流动相和固定相[1]之间进行反复多次的分配平衡，由于各组分在两相间的分配系数不同，因而各组分沿色谱柱移动的速度也不同。当通过适当长度的色谱柱后，各组分彼此间就会拉开一定的距离，先后流出色谱柱，即发生分离，至检测器给出信号，最后由数据系统进行数据的采集、储存、显示、打印和数据处理工作。

在液液分配色谱中，反相色谱最常用的固定相是十八烷基键合固定相，正相色谱常用的是氨基、氰基键合固定相。醚基键合固定相既可用于正相色谱，又可用于反相色谱。键合相不同，分离性能也不同。固定相确定之后，用适当的溶剂调节流动相，可以得到较好的分离。若改变流动相后仍不能得到满意的结果，可以变换固定相或采取不同固定相的柱子串联使用。如果样品比较复杂，则需采用梯度洗脱方式，即在整个分离过程中，溶剂强度连续变化。这种变化是按一定程序进行的。

2．　高压液相色谱仪

高压液相色谱仪由输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和数据处理系统组成。其简单流程如图221所示。

图221高压液相色谱仪

在一根不锈钢制的封闭色谱柱内，紧密地装入高效微球固定相，用高压泵连续地按一定流量将溶剂送入色谱柱。然后，用进样器将样品注入色谱柱的顶端，用溶剂连续地冲洗色谱柱，样品中各组分会逐渐地被分离开来，并按一定顺序从柱后流出。而后进入检测器，将各组分浓度的变化转换成电信号，经放大后送入记录仪而绘出色谱图。

3．　高压液相色谱法的特点

高压液相色谱的定性、定量分析方法与气相色谱法[2]基本相同。它具有如下一些特点：

①　高压由于溶剂（流动相）的黏度比气体大得多，色谱柱内填充了颗粒很小的固定相，当溶剂通过柱时会受到很大阻力。一般1m长的色谱柱的压降为7.5×106Pa。所以，高压液相色谱都采用高压泵输液。

②　高速溶剂通过柱子的流量可达3～10mL/min，制备色谱达10~50mL/min，使分离速度增大，可在几分钟至几十分钟内分析完一个样品。

③　高效高压液相色谱使用了高效固定相，其颗粒均匀，直径小于10μm，表面孔浅，质量传递快，柱效很高，理论塔板数可达104块/m。

④　高灵敏度采用高灵敏度的检测器，如紫外吸收检测器的灵敏度很高，最小检出限可达5×10-10g/mL，示差折光检测器为5×10-7g/mL。【注释】

[1]　高压液相色谱的流动相和固定相。①　流动相：液相色谱的流动相在分离过程中有较重要的作用，因此在选择流动相时，不但要考虑到检测器的需要，同时又要考虑它在分离过程中所起的作用。常用的流动相有正己烷、异辛烷、二氯甲烷、水、乙腈、甲醇等。在使用前一般都要过滤、脱气，必要时需要进一步纯化。②　固定相：常用固定相类型有全多孔型、薄壳型、化学改性型等。常用固定相有β′,β氧二丙腈、聚乙二醇、角鲨烷等。

[2]　高压液相色谱法与气相色谱法的比较。①　气相色谱法要求样品能瞬间气化、不分解，适于分析低中沸点、相对分子质量小于400而又稳定的有机化合物（占有机化合物总数的15%～20%）。液相色谱一般在室温下进行，要求样品能配制成溶液就行，适于高沸点、热稳定性差、相对分子质量大于400的有机物的分离分析。②　在气相色谱中，只有色谱固定相可供选择，因为载气种类少，想通过改变载气种类以改变组分的分离度是不可行的。在高压液相色谱中，有两种可供选择的色谱相，即固定相和流动相。固定相可有多种吸附剂、高效固定相、固定液、化学键合相供选择；流动相有单溶剂、双溶剂、多元溶剂，并可任意调配其比例，达到改变载液的浓度和极性，进而改变组分的容量因子，最后实现分离度的改善。③　气相色谱中若要回收被分离组分很困难，液相色谱却比较容易，只要把一个容器放在柱子的末端，就可以将所分离的某个流出物加以收集。这样可为进一步利用红外、核磁等方法确定化合物结构提供纯样品。